دانلود پایان نامه دامپزشکی مروري بر روشهاي ويروس شناسي «تخم مرغ جنين دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR»

فهرست:

1- كشت سلول

2- كشت ويروس در تخم مرغ جنين دار

3- اليزا “ELISA”

4- ممانعت از هماگلاتيناسيون “HI”

5- واكنش زنجيره هاي پليمراز

مقدمه

تعداد زيادي از بيماريهاي انسان، حيوان و گياه با وجود اينكه واگير و قابل انتقالند توسط باكتريها، قارچها، پروتزوئرها و به طور كلي توسط عواملي ايجاد مي شود كه نمي توان آنها را با ميكروسكوپ عادي ديد، و عفوني بودن اينگونه بيماريها را مي‌توان با تزريق مواد آلوده ويا پاليده آنها به دامهاي حساس به اثبات رسانيد.

ويروسها ازجمله كوچكترين عوامل عفوني مي باشند كه به علت دارا بودن خصوصيات مختص خود با ساير موجودات زنده تفاوت دارند. ويروسها را نمي توان درمحيطهاي مصنوعي آزمايشگاهي به راحتي تشخيص داد و بمنظور كشت، جداسازي و نهايتاَ شناسائي آنها از حيوانات حساس، تخم مرغ جنين دار و كشت سلول استفاده مي شود. در اثر استفاده از تخم مرغ جنين دار براي كشت ويروسها پيشرفت قابل ملاحظه اي درراه شناسايي و جداسازي اين عوامل عفوني حاصل شده است.

بيشتر ويروسها به ميزبان ويژه اي اختصاص دارند به نحوي كه دربدن ميزبان اختصاصي نيز، بافت و يا سلولهاي ويژه اي را جهت تكثير و بقاي خود انتخاب مي‌كنند. با توجه به دارا بودن چنين شرايط انحصاري دراين دسته ازميكروارگانيسمهاي عفوني مي توان بااستفاده از روشهاي مخصوص و تكنيكهاي مناسب تعداد زيادي از ويروسها را به رشد دربافت ميزبان ديگر عادت داد.

نظر به اينكه ياخته ها و پرده هاي غشائي اطراف جنين مرغ مانند بيشتر بافتهاي جنين فعاليتهاي اختصاصي دقيقي ندارند رشد و تكثير تعداد زيادي از ويروسها درآنها امكان پذير مي باشد.

تخم‌هاي مرغ‌هاي جنين دار كه درمراحل گوناگون رشد مي باشند با بكارگيري روشهاي مختلفي مي توان درآنها تلقيح نمود بعد از تلقيح تخم مرغها را درشرايط مناسب نگهداري نموده و هر روز بررسي مي نمايند. روشهاي استانداردي جهت تلقيح ويروسهاي مختلف به غشاء كوريوآلانتوئيك، كيسه آمنيوتيك، كيسه آلانتوئيك، كيسه زرده يا جنين، داخل مغز جنين و داخل عضلاني موجود است. مايع يا بافتهاي آنها را پس مدت زمان برداشته و تكثير ويروس يا آسيب‌هاي ناشي از آن رابررسي مي‌كنند.

واكنش بين ويروس وميزبان خيلي اختصاصي بوده و از نظر بيولوژي ويروسها، بازتاب تنوع سلولهاي ميزبان آنها مي باشد. تنوع دربين ويروسها به روشهاي گوناگوني كه ويروسها براي تكثير و باقي ماندن ازخود نشان مي دهند بستگي دارد.

درزمينه كشت ويروسها نيز قدمهاي مهم و با ارزشي برداشته شده است تلقيح به تخم مرغ يا استفاده از كشت سلول كه به ترتيب توسط ودروف (Woodruff) و پاركر (Parker) انجام پذيرفت ازمفيدترين روشهاست كه براي رشد ويروسها به كاررفته است و درحال حاضر در آزمايشگاههاي ويروس شناسي مورد استفاده مي باشد پيشرفتهايي كه درزمينه علوم بيوفيزيك، بيوشيمي، ايمني شناسي و ژنتيك حاصل شده، به شناخت ماهيت ويروسها كمك قابل توجهي كرده است. استفاده از دستگاههايي نظير ميكروسكوپ الكتروني، اولتراسانتريفوژ، ميكروسكوپ فلورسنت و اولترافيلتر درپيشبرد ويروس شناسي بسيار موثربوده است.

روشهاي مختلف تشخيص آزمايشگاهي بيماريهاي ويروسي برسه اصل استوار است

1. جداسازي ويروس

2. روشهاي سرمي

3. روشهاي ملكولي

1-1 جداسازي ويروس

براي كشت و جداكردن ويروسها معمولاً ازحيوانات حساس، تخم مرغ جنين دار ويا كشت سلول استفاده مي شود. نمونه هاي مايع را كه عاري از باكتري باشند مي توان مستقيماً و يا پس از رقيق كردن به محيط زنده تلقيح نمود. نمونه هاي جامد را بايد درمحلول تامپون به نسبت 20-10 درصد به صورت تعليق درآورد. سپس توسط سانتريفوژبا دوركم ذرات معلق راجدا ساخت و مايع را دوباره سانتريفوژ كرده و سپس اقدام به كشت نمود.

1- ا- الف-كشت درتخم مرغ جنين دار

دراثر استفاده از تخم مرغ جنين دار براي كشت ويروسها پيشرفت قابل ملاحظه اي درراه شناسايي و جداسازي اين عوامل بوجود آمده است. نظر به اينكه بافت ها و پرده هاي غشايي اطراف جنين مرغ مانند بيشتر بافتهاي جنين فعاليتهاي اختصاصي دقيقي ندارند، رشد تعداد زيادي از ويروسها درآنها امكان پذير مي باشد.

1-1- ب - جداكردن دركشت سلول

پيشرفتهاي حاصل دركشت سلول وسيله با ارزشي براي جداسازي و تكثير ويروسها در اختيار ويروس شناسان قرارداده است. ازدياد ويروس دركشت سلول را مي توان به روشهاي مختلف ازقبيل اثر بيماري زائي درسلول(CPE) تداخل ويروسها(Interference)، جذب گلبولهاي قرمز به ياخته هاي حاوي ويروس (Hemadsorption) هماگلوتنيشن(HA)، جستجوي آنتي ژن توسط ايمونوفلورسنت و يا ثبوت مكمل (CFT) تشخيص داد.

1-1-ج - كشت و جداكردن ويروس درحيوانات

انتخاب حيوان حساس براي جداكردن ويروس نكته اصلي دراين روش است كه دراين رابطه فاكتورهاي ضروري زيررا مي بايست درنظر گرفت.

1-سن حيوان

2-ميزبان طبيعي ويروس

3-منشأ حيوان

درحال حاضر ازاين روش به ندرت استفاده مي شود و بيشتر دربررسيهاي ويروس شناسي كاربرد دارد.

2-1- تشخيص بيماريهاي ويروسي توسط آزمايشهاي سرمي

عفونتهاي ويروسي معمولاً با واكنشهاي ايمني هومورال و سلولي همراه است، بنابراين سنجش هر يك ازآنها وسيله اي براي تشخيص بيماري مي باشد.

ازجمله آزمايشات سرمي متداول مي توان به موارد زير اشاره كرد:

1-آزمايشهاي خنثي سازي(NT)

2-واكنش ثبوت مكمل (CFT)

3-واكنش جلوگيري از جمع شدن گلبولهاي قرمز(HI)

4-واكنش ايموديفوژن (I D)

5-واكنش ايمونوفلورسنس (FA)

6-آزمايش ELLSA

3-1- شناسايي بيماريهاي ويروسي توسط آزمايشات ملكولي

تاريخچه تلقيح به تخم مرغ جنين دار

اولين بار دانشمندي به نام Good Pasture درسال 1913 به اين فكر افتاد كه عوامل عفوني را داخل تخم مرغ جنين دار كشت دهد تلاش براي ابداع اين روش تا سال 1930 به طول انجاميد. بخش عمده اي از ويروسهاي حيواني وانساني را مي توان به طور مستقيم و يا پس از عادت دادن درقسمتهاي مختلف تخم مرغ جنين دارد تكثير نمود. وسايل كار نسبتاً ساده بوده و مهارت لازم دراين زمينه را مي توان درمدت زماني معقول فراگرفت. امروزه بخش وسيعي از واكسنهاي حيواني و انساني و بيش از 90 درصد واكسنهاي طيور با اين روش تهيه مي گردد.

2-1- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنين دار

1-دردسترس بودن تخم مرغ نطفه دار و روش انكوباسيون آسان آن

2-امكان انجام تزريق دربخشهاي مختلف تخم مرغ جنين دار

3-عمل تلقيح ويروس حتي در آزمايشگاههاي با امكانات كم در شرايط مناسب قابل اجراست.

4-امكان نفوذ آلودگي ازخارج به داخل تخم مرغ بسيار كم است.

5-ميزان تكثير ويروس درداخل تخم مرغ جنين دار معمولاً زياد است.

2-2 منبع تهيه تخم مرغ

منبع تهيه تخم مرغ براي كارهاي دقيق ويروسي و توليد واكسن، گله هاي SPF مي‌باشد ولي براي كارهاي روتين مي توان از گله هاي مادر پاك با مديريت خوب استفاده نمود. بايد توجه داشت كه تخم مرغ جنين دار ممكن است حامل عوامل ميكروبي و ويروسي مانند سالمونلا، مايكوپلاسما، انسفالوميليت، لكوز طيور، نيوكاسل، هپاتيت ويروسي و غيره باشد.

بهتر است تخم مرغ نطفه دار را بلافاصله درانكوباتور مخصوص قرارداده تا جنين رشد كرده و درسن مطلوب مورد تزريق قرارگيرد. اما مي توان آنرا به مدت 5 الي 6 روز به طور مطلوب در 18-15 درجه و درصورت لزوم 15 الي 20 روز در 12 درجه سانتيگراد توأم با كاهش احتمالي ميزان باروري نگهداري نمود. بديهي است وجود اطلاعاتي درمورد گله توليد كننده ازقبيل برنامه واكسيناسيون، عيار آنتي بادي، بيماري هاي گله و داروهاي مورد استفاده درقبل يا درهنگام توليد براي ويروس شناس بسيار مفيد خواهد بود. آگاه بودن از آلودگي ويروسي و عيار آنتي بادي باعث مي شود كه تزريق با دقت كافي ودرمحل مناسب صورت پذيرد به فرض مثال در آلودگي با نيوكاسل نبايد تزريق را دركيسه زرده انجام دهيم.

معمولاً تخم مرغ نطفه دار درماشين جوجه كشي كه قبلاً ضدعفوني شده دردرجه حرارت و رطوبت مناسب قرار مي گيرد تا رشد كند. ازانكوباتورهاي معمولي نيز مي‌توان استفاده نمود. به اين ترتيب كه درجه حرارت 5/37 الي 38 و رطوبت 40 الي 70 درصد را تأمين نموده و تخم مرغها را روزي دوبار و ترجيحاً چهار بار با دست بچرخانيم. بعد از 5-3 روز اولين كندلينگ براي بررسي باروري تخم مرغ صورت گيرد دراين مرحله تخم مرغهاي بدون جنين و يا داراي جنين مرده حذف شوند.

در 5-3 روزگي فقط آثار عروق خوني مشاهده مي شود.

كندلينگ براي بار دوم قبل از تلقيح، بسته به نوع ويروس و راه تزريق درروزهاي 8 و 10 و 11و 12 صورت مي گيرد. بعد از تزريق محل تلقيح مسدود و تخم مرغها را به طور ثابت در همان درجه حرارت يا كمي پايين تر به مدت 2 الي 9 روز بسته به نوع ويروس قرار مي گيرند. بايد توجه داشت كه تمام اجزاي جنين تخم مرغ عفوني تلقي مي‌گردد و به هنگام بازكردن نبايد ازدريل يا ديسك كاربوراندوم استفاده كرد زيرا ايجاد ائروسل مي‌نمايد و بهتر است از پنس وقيچي استفاده نمود و عمليات مربوطه درزير هود ميكروبيولوژي انجام پذيرد.

البته پس از برداشت تخم مرغها آنها را به مدت 6-4 ساعت در 4 درجه سانيگراد قرار مي دهيم. اين عمل به منظور انقباض عروق و توقف جريان خون و به حداقل رساندن خونريزي درهنگام صورت مي پذيرد سپس محتويات تخم مرغ به منظور بررسي حضور ويروس مورد بازرسي قرار مي گيرد.

3-2 علائم رشد ويروس

برخي ويروسها تغييرات مورفولوژيكي بوجود مي آورند درحالي كه برخي ديگر باعث مرگ جنين و يا توليد هماگلوتينين ها مي گردند. بايد توجه داشت كه جابجائي خشن و تزريق نامناسب و آلودگي باكتريائي مي تواند موجب مرگ سريع جنين شود كه درهمه موارد توأم با بوي گنديدگي نخواهد بود. و درموارد مشكوك بايد كشت باكتريائي صورت گيرد.

4-2 ساختمان تخم مرغ جنين دارد

1-زرده: حاوي مواد غذايي از قبيل 48 درصد آب –5/17 درصد پروئين –5/32 درصد چربي –يك درصد كربوهيدرات – يك درصد املاح

2-كيسه زرده: باترشح آنزيمهائي محتويات زرده را به صورت محلول درآورده و براي جنين قابل استفاده مي كند.

3-آمنيون: (مايع و غشاء) كيسه آمنيوتيك حاوي مايع آلبوميني به نام مايع آمنيوتيك مي باشد كه جنين درآن شناور مي باشد.

4-الانتوئيس: شامل غشاء و مايع الانتوئيك مي باشد. پرده الانتوئيك به عنوان سيستم گردش خون عمل مي كند و وقتي كاملاً رشد كرد اطراف جنين را فراگرفته و آنرا احاطه مي كند. پرده الانتوئيك ازروز سوم جنين شروع به تشكيل كرده و تا روز 12 تكميل مي شود.

اعمال غشاء الانتوئيك شامل:

الف-تنفس: بوسيله جريان خون اكسيژن به جنين رسانده ودي اكسيد كربن آنرا مي‌گيرد.

ب-دفع: اين غشاء مواد دفعي حاصل ازعمل تصفيه كليوي جنين را گرفته و درحفره الانتوئيك مي‌ريزد.

ج-گوارش: به هضم آلبومين و جذب كلسيم ازپوسته تخم مرغ كمك مي كند.

5-غشاء زير پوسته آهكي:

اين غشا نقش فيزيولوژيك با اهميتي ندارد.

6-پوسته آهكي:

اين پوسته ازخارج بوسيله لايه نازك كوتيكول پوشيده شده و عمدتاً ازكربنات كلسيم تشكيل شده است. كوتيكول سد محافظتي دربرابر عبور اجرام عفوني ايجاد مي كند.

5-2 رشد جنين درسنين مختلف

درروز اول و دوم آثار بسيار ظريف عروق خوني قابل مشاهده است.

در روز سوم عروق خوني قابل مشاهده بوده و ممكن است جنين به صورت لكه كوچكي مشاهده شود.

درروز پنجم عروق خوني گسترش يافته و جنين قابل مشاهده مي باشد.

ازروز هشتم به بعد موقعيت فضاي آمينوتيك قابل تشخيص و تعيين است و درروز 14 به بعد جنين به صورت توده ديده مي شود.

درروز 20-19 اطاقك هوائي مشاهده نمي شود.

6-2 راههاي تزريق

داخل زرده : ازتخم مرغ 5 الي 7 روزه به منظور جداسازي، بلوتانگ-هاري-كلاميديا

مايع آمنيوتيك: ازتخم مرغ 10 الي 12 روزه به منظور جداسازي آنفلونزاي تيپ A و B

مايع الانتوئيك: ازتخم مرغ 9 الي 11 روزه به منظور جداسازي نيوكاسل.

پرده كوريولانتوئيك: ازتخم مرغ 10 الي 12 روزه به منظور جداسازي ويروس آبله.

داخل وريدي: ازتخم مرغ 11 الي 13 روزه به منظور جداسازي ويروس بلوتانگ وآربوويروسها.

داخل مغز جنين: درتخم مرغ 12 روزه به منظور جداسازي ويروس آنسفاليت.

داخل عضلاني:

7-2 موارد استعمال تخم مرغ جنين دار SPF درتشخيص ويروسها

الف-ويروسهائي كه درتمام قسمتهاي تخم مرغ جنين دار رشد مي كنند.

1-طاعون مرغي

2-نيوكاسل

3-آنسفاليت اسب

ب-ويروسهائي كه روي پرده كوريوالانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحات شديد مي كنند.

1-آبله طيور

2-نيوكاسل

3-لارنگوتراكئيت

4-واكسين

5-آبله انسان

6-هرپس سيمپلكس

7-ميكزوماي خرگوش

ج-ويروسهائي كه روي پرده كوريولاانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحات مختصر مي كنند.

1-آنفلوانزاي Aو B

2-لنفوگرانولوماتوز

3-لوپينگ ايل

4-ويروس بيماري كاره

5-سرخجه

د-ويروسهاي كه درروي پرده كوريوالانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحت نمي‌كنند.

1-هاري

2-سرخك

3-سرخجه

4-برونشيت عفوني

ه-ويروسهائي كه درحفره الانتوئيك رشد مي كنند.

1-گريپ A و B

2-سويه نوروتروپيك گريپ

3-پارا آنفوآنزا

4-طاعون مرغي

5-نيوكاسل

6-اوريون

7-پوليوميليت تيپ II

و-ويروسهائي كه درحفره آمنيوتيك رشد مي كنند .

1-گريپ A و D و C

2-گريپ نورروتروپيك

3-پاراآنفلوانزا

4-نيوكاسل

5-اريون

6-گرانولوماتوزعفوني

ي – ويروسهائي كه دركيسه زرده رشد مي كنند.

1-گريپ A و B

2-آنفلوآنزاي A و B

3-هرپس سيمپلكس

4-لنفوگرانولوماتوزعفوني

5-اريون

6-هاري

7-آربوويروسها

8-پارا انفلانزا

8-2- روشهاي مختلف كشت عوامل ويروسي درتخم مرغ جنين دار SPF

مقدمات تزريق

مكان تزريق بايد به چراغ اولتراويوله مجهز باشد وعمل تزريق درشرايط كاملاً بهداشتي حتي الامكان استريل انجام گيرد.

وسايل موردنياز شامل

1) سيني حمل تخم مرغ

2) محلول الكل يده (تنتوريد)

3) پنسهاي كوچك و متوسط

4) قيچيهاي متوسط با نوك تيز و گرد

5) سرنگ و سرسوزن دراندازه هاي مختلف

6) دريل و ديسك مناسب جهت سوراخ كردن پوسته

7) پارافين

8) انواع پيپت و پيپت پاستور

9-2 روش تزريق درحفره الانتوئيك

عمدتاً درتخم مرغ 11-9 روزه صورت مي‌گيرد و به دو روش امكان پذير است.

روش اول

1)تخم مرغ را كندلينگ ودرصورت مشخص بودن عروق وزنده بودن جنين موقعيت آنرا همراه با مرز اطاقك هوائي درروي پوسته آهكي مشخص مي كنيم.

2) تخم مرغ را به آرامي و به طور عمودي درسيني آن قرار مي دهيم به نحوي كه اطاقك هوائي روبه بالا باشد.

3) ناحيه اي از پوسته روي اطاقك هوائي را درطرف مقابل محل علامت گذاري شده (سمتي كه دور از جنين قراردارد) 2 الي 3 ميلي متر بالاتر از مرز اطاقك هوائي انتخاب نموده وبا محلول تنتوريد ضد عفوني مي كنيم.

4)به كمك دريل و ديسك كاربر‌اندوم محل ضدغفوني شده را طوري شكاف مي دهيم كه به غشاء زير پوسته آسيبي وارد نشود.

5) به كمك سرنگ انسولين متصل به يك سرسوزن به طول 5/1 سانتي متر 1/0 الي 2/0 سي سي از نمونه ويروسي به طور عمودي و به آرامي تزريق مي گردد.

6) با كمك پارافين مذاب (دو قسمت پارافين پاتولوژي + يك قسمت وازلين) استريل محل تزريق به طور موضعي مسدود مي گردد و تخم مرغ به طور ثابت و بدون حركت درانكوباتور قرار مي‌گيرد.

روش دوم

1-پس از اطمينان از زنده بودن جنين به هنگام كندلينگ درهمان حالت درنقطه مقابل جنين و درروي پوسته آهكي درمنطقه بين رگهاي خوني (فاقد رگ خوني) و پايين تر از اطاقك هوائي علامت گذاري صورت مي گيرد.

2-تخم مرغ به همان حالت افقي و به آرامي برروي سيني مخصوص قرارداده شده و ناحيه علامت گذاري شده ضد عفوني مي گردد.

3-به كمك دريل و ديسك منطقه ضد عفوني شده بدون آسيب رساندن به غشاء زير پوسته شكافته مي شود.

4-با كمك يك سرسوزن بسيار ظريف (انسولين) و سرنگ انسولين به عمق نيم سانتي متر وارد فضاي الانتوئيك تخم مرغ گرديده و 1/0 الي 2/0 سي سي نمونه ويروسي به طور بسيار آهسته تزريق مي گردد. (براي جلوگيري از پس زدن آهسته تزريق مي شود.

5-باكمك پارافين محل تزريق مسدود گرديده و تخم مرغ به طول ثابت وبدون حركت به همان حالت افقي درانكوباتور قرار مي گيرد.

10-2 روش تزريق درحفره آمينوتيك

معمولاً تخم مرغ ها درسن 8 الي 11 روزه و 10 الي 12 روزه بسته به نوع ويروس مورد تزريق قرارمي گيرد. تزريق درحفره آمينوتيك به سه روش انجام مي شود.

روش اول

1- كندلينگ و تعيين موقعيت جنين و كيسه هوائي

2- ناحيه اي از پوسته درسمت جنين چند ميليمتربالاتر از مرز اطاقت هوائي ضد‌عفوني مي شود.

3- تراش بوسيله دريل و ديسك

4- باسرسوزن به طول cm5/1 به طور عمودي ازمحل شكاف وارد فضاي آمنيوتيك شده و cc 1/0 ازنمونه ويروسي تزريق مي شود.

5- مسدود كردن سوراخ با پارافين و قراردادن درانكوباتور

روش دوم

1- كندلينگ نمودن تخم مرغ و تعيين موقعيت جنين

2- پوسته آهكي ناحيه اي كه جنين قراردارد را ضد عفوني كرده و بدون صدمه زدن به غشاء زير پوسته آهكي با كمك ديسك پوسته آهكي شكافته مي شود.

3- به كمك يك سرسوزن به طول cm 5/2 و قطر G 32 در حالي كه تخم مرغ به طور افقي روي چراغ كندلينگ قرار دارد عمل تزريق انجام مي شود. توجه گردد كه ورود سرسوزن به حفره آمنيوتيك باعث جابجا شدن جنين خواهد شد و اين نشانه‌اي از تزريق درمكان صحيح مي‌باشد.

4- تزريق 1/0 الي 2/0 cc مايع ويروسي

5- قراردادن تخم مرغ بدون حركت درانكوباتور

روش سوم

1- كندلينگ و مرز اطاقك هوائي دورتا دورتخم مرغ مشخص مي گردد.

2- پوسته اطاقك هوائي را كاملاً ضد عفوني كرده و تخم مرغ به طور عمودي درسيني قرارداده مي شود به طوري كه اطاقك هوائي رو به بالا است.

3- به كمك دريل و ديسك 1-2mm بالاتر ازمرز اطاقك هوائي در دور تا دور تخم مرغ پوسته به طور كامل تراش داده مي شود و سپس پوسته اطاقك به طول كامل برداشته مي شود.

دراين حالت كف اطاقك هوائي كه شامل غشاء زير پوسته وغشاء كوريوالانتوئيك مي باشد ظاهر مي گردد.

تعداد صفحات:110

متن کامل را می توانید دانلود نمائید چون فقط تکه هایی از متن در این صفحه درج شده (به طور نمونه) و ممکن است به دلیل انتقال به صفحه وب بعضی کلمات و جداول و اشکال پراکنده شده یا در صفحه قرار نگرفته باشد که در فایل دانلودی متن کامل و بدون پراکندگی با فرمت وردwordکه قابل ویرایش و کپی کردن می باشند موجود است.